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1 - Obtenção e cultivo das células-tronco mesenquimais de medula óssea
As amostras de medula óssea são obtidas a partir de fêmures de ratos adultos (250 g) da linhagem Wistar. Para cada período de cultivo (cultura nova e antiga) foi utilizado um rato. Os animais são sacrificados por overdose de anestésico (tiopental sódico - Cristália; 3,5 mL/animal ) e têm os dois fêmures dissecados, eliminando os tecidos muscular e conjuntivo associados. Em seguida são feitos dois cortes na região das epífises, removendo-as, possibilitando a entrada da agulha na cavidade medular, onde são injetados 10 mL de DMEM (Dulbeco´s Modified Eagle Medium - GibcoBRL) sem soro.
O material obtido é ressuspenso e centrifugado a 1.500 rpm durante 10 minutos. O pellet é ressuspenso em DMEM sem soro, num volume de cerca de 4 mL e transferido para um outro tubo de 15 mL contendo 4 mL de Ficoll-Paque (densidade 1.077 g/mL - Amersham Biosciences) (diluição Ficoll:meio de 1:1), evitando que as duas fases líquidas se misturem. Centrifuga-se a 2.000 rpm durante 30 minutos à temperatura ambiente. A seguir, coleta-se o anel de células na interface Ficoll-células e as ressuspende em solução BSS respeitando a diluição 1:5 (células:BSS). Centrifuga-se novamente a 1.500 rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente, desprezando o sobrenadante. Esse procedimento deve ser repetido mais duas vezes a fim de retirar o excesso de Ficoll, que é tóxico para as células.
Após a última lavagem, o pellet é ressuspenso em 1 mL de DMEM com 20% de soro fetal bovino (SFB – StemCell Technology) e então as células são contadas, utilizando Trypan Blue (GibcoBRL) para acessar a viabilidade das células extraídas. Por final as células são plaqueadas em frascos canted neck com filtro (Corning), de 25 cm2, com 5 mL de meio de cultura composto por DMEM 20% SFB acrescido de 1% de penicilina e estreptomicina (StemCell Technology) e de 4% de L-glutamina (GibcoBRL).
São plaqueadas 1x106 células na cultura mais antiga e 3x106 células na cultura considerada nova. As células foram mantidas em estufa a 37 oC em 5% de CO2 e umidade de 95%. O meio de cultura é trocado a cada 3 ou 4 dias, retirando-se 4 mL do meio acondicionado e substituindo-se por 4 mL de meio fresco.
Quando as células em cultivo alcançavam confluência de aproximadamente 80%, era feita a passagem. Removendo o meio de cultura do frasco, as células mesenquimais aderentes permanecem aderidas ao frasco. Essas células devem ser lavadas com DMEM sem soro para remover o SFB residual e depois incubadas com 1 mL de tripsina e EDTA (StemCell Technology), a 37 ºC até se destacarem (cerca de 4 minutos). Às células já soltas, adiciona-se meio de cultura com 20% de SFB para neutralizar a ação da tripsina. As células são centrifugadas a 1200 rpm por 5 minutos, então o sobrenadante é removido e o pellet é ressuspenso em meio de cultura completo (DMEM + 20% SFB). Essas células podem agora ser divididas em novos frascos de 25 cm2 para cultura. A cultura de células antiga sofreu 4 passagens, sendo que na primeira a concentração foi de 1:4, na segunda, terceira e quarta passagens foi de 1:10. Já a cultura nova permaneceu na passagem 0 até a realização dos experimentos.
Indução de diferenciação - O protocolo de indução da diferenciação das células-tronco mesenquimais em células neurais consiste nas seguintes etapas:
Pré-indução: o meio de cultura é substituído pelo meio pré-indutor, composto por DMEM / 20% SFB e 1 mM de b-mercaptoetanol (Sigma), sendo as células incubadas nessa solução durante 24h.
Indução: posteriormente recebem tratamento com os indutores neurais butil-hidroxi-anizol (BHA / butylated hydroxyanisole - Sigma) (200 mM) e dimetil-sulfóxido (DMSO - Sigma) (2%) em DMEM. A solução de BHA deve ser feita em álcool 70%. Para posterior realização da imunocitoquímica foram adotados dois intervalos de tempo para a indução neural: 24 e 72 horas, após os quais as células são fixadas.
2 - Obtenção e cultivo das células-tronco neurais
As células-tronco neurais são obtidas a partir de encéfalo de embrião E14 e da zona subventricular (SVZ) de adulto, ambos de camundongos da linhagem balb/c. Os animais utilizados são sacrificados por deslocamento cervical.
Tanto os embriões de camundongo E14 quanto o encéfalo de camundongo adulto são depositados em uma placa de Petri contendo PBS com 2% de glicose. A dissecção é feita em uma lupa e o material obtido é transferido para um tubo adicionando-se em seguida 5 mL do meio de cultura suplementado. A seguir o tecido é triturado passando pela pipeta com ponteira de 1.000 mL seguido pela ponteira de 200 mL, até obter-se uma suspensão de células únicas. As células obtidas são quantificadas e a viabilidade avaliada usando Trypan Blue (GibcoBRL).
As células são plaqueadas em frascos T-25 canted neck (Corning) na densidade de 2x105 células por mL em 10 mL de meio de cultura completo. O meio de cultura para as células tronco neurais é composto por 10% de NeuroCultTM NSC Proliferation Supplements (StemCell Technology) e 90% de NeuroCultTM NSC Basal Medium (StemCell Technologies), específicos para murinos. Além disso também deve ser adicionado hEGF (20 ng/mL), FGF-2 (20 ng/mL) e heparina (5 mg/mL). As neuroesferas são centrifugadas a 1.200 rpm por 5 minutos e metade do meio de cultura de cada frasco é trocado a cada 3 ou 4 dias, substituindo por meio de cultura fresco. As neuroesferas formadas são mantidas numa estufa a 37 ºC, com controle de umidade (maior que 95%) e da proporção de CO2 (5%) no ar.
Indução de diferenciação - Primeiramente as neuroesferas devem ser dissociadas mecanicamente – passando-se pelas ponteiras de 1.000 mL e de 200 mL – e plaqueadas em lamínulas de vidro revestidas com poli-lisina e laminina, que promovem a adesão das células. Após terem aderido, permanecem em poços (Multiwell de 12) contendo 1 mL de meio de cultura composto por NeuroCultTM NSC Basal Medium, NeuroCultTM NSC Proliferation Supplements e 2% de soro fetal bovino (SFB) (StemCell Technology), sem fatores de crescimento. As células são mantidas nesse meio de cultura em estufa (37 ºC, 5% CO2, umidade > 95%) por 1 dia, quando inicia-se o tratamento com o meio de indução de diferenciação.
Cada poço recebe uma combinação específica de compostos, adicionados ao meio de cultivo descrito acima (volume final = 1 mL), que induzem diferenciação em determinado tipo celular, como segue adiante:
a) Diferenciação neuronal: adiciona-se ácido-retinóico all-trans (RA) (Sigma) e forscolina (Fsk) (Sigma) em concentração final de 0,1 mM e 5 mM, respectivamente.
b) Diferenciação em astrócito: adiciona-se 50 ng/mL de proteína morfogenética de osso-2 (BMP-2 - R&D System), 50 ng/mL de fator inibitório de leucemia (LIF - Sigma) e 1% de soro fetal bovino (StemCell Technology).
c) Diferenciação em oligodendrócito: adiciona-se 500 ng/mL de IGF-1 (insulin-like growth factor-1 - R&D System).
As células permanecem no meio indutor de diferenciação por 5 dias, que é substituído no terceiro dia.
1 - Obtenção e cultivo das células-tronco mesenquimais de medula óssea
As amostras de medula óssea são obtidas a partir de fêmures de ratos adultos (250 g) da linhagem Wistar. Para cada período de cultivo (cultura nova e antiga) foi utilizado um rato. Os animais são sacrificados por overdose de anestésico (tiopental sódico - Cristália; 3,5 mL/animal ) e têm os dois fêmures dissecados, eliminando os tecidos muscular e conjuntivo associados. Em seguida são feitos dois cortes na região das epífises, removendo-as, possibilitando a entrada da agulha na cavidade medular, onde são injetados 10 mL de DMEM (Dulbeco´s Modified Eagle Medium - GibcoBRL) sem soro.
O material obtido é ressuspenso e centrifugado a 1.500 rpm durante 10 minutos. O pellet é ressuspenso em DMEM sem soro, num volume de cerca de 4 mL e transferido para um outro tubo de 15 mL contendo 4 mL de Ficoll-Paque (densidade 1.077 g/mL - Amersham Biosciences) (diluição Ficoll:meio de 1:1), evitando que as duas fases líquidas se misturem. Centrifuga-se a 2.000 rpm durante 30 minutos à temperatura ambiente. A seguir, coleta-se o anel de células na interface Ficoll-células e as ressuspende em solução BSS respeitando a diluição 1:5 (células:BSS). Centrifuga-se novamente a 1.500 rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente, desprezando o sobrenadante. Esse procedimento deve ser repetido mais duas vezes a fim de retirar o excesso de Ficoll, que é tóxico para as células.
Após a última lavagem, o pellet é ressuspenso em 1 mL de DMEM com 20% de soro fetal bovino (SFB – StemCell Technology) e então as células são contadas, utilizando Trypan Blue (GibcoBRL) para acessar a viabilidade das células extraídas. Por final as células são plaqueadas em frascos canted neck com filtro (Corning), de 25 cm2, com 5 mL de meio de cultura composto por DMEM 20% SFB acrescido de 1% de penicilina e estreptomicina (StemCell Technology) e de 4% de L-glutamina (GibcoBRL).
São plaqueadas 1x106 células na cultura mais antiga e 3x106 células na cultura considerada nova. As células foram mantidas em estufa a 37 oC em 5% de CO2 e umidade de 95%. O meio de cultura é trocado a cada 3 ou 4 dias, retirando-se 4 mL do meio acondicionado e substituindo-se por 4 mL de meio fresco.
Quando as células em cultivo alcançavam confluência de aproximadamente 80%, era feita a passagem. Removendo o meio de cultura do frasco, as células mesenquimais aderentes permanecem aderidas ao frasco. Essas células devem ser lavadas com DMEM sem soro para remover o SFB residual e depois incubadas com 1 mL de tripsina e EDTA (StemCell Technology), a 37 ºC até se destacarem (cerca de 4 minutos). Às células já soltas, adiciona-se meio de cultura com 20% de SFB para neutralizar a ação da tripsina. As células são centrifugadas a 1200 rpm por 5 minutos, então o sobrenadante é removido e o pellet é ressuspenso em meio de cultura completo (DMEM + 20% SFB). Essas células podem agora ser divididas em novos frascos de 25 cm2 para cultura. A cultura de células antiga sofreu 4 passagens, sendo que na primeira a concentração foi de 1:4, na segunda, terceira e quarta passagens foi de 1:10. Já a cultura nova permaneceu na passagem 0 até a realização dos experimentos.
Indução de diferenciação - O protocolo de indução da diferenciação das células-tronco mesenquimais em células neurais consiste nas seguintes etapas:
Pré-indução: o meio de cultura é substituído pelo meio pré-indutor, composto por DMEM / 20% SFB e 1 mM de b-mercaptoetanol (Sigma), sendo as células incubadas nessa solução durante 24h.
Indução: posteriormente recebem tratamento com os indutores neurais butil-hidroxi-anizol (BHA / butylated hydroxyanisole - Sigma) (200 mM) e dimetil-sulfóxido (DMSO - Sigma) (2%) em DMEM. A solução de BHA deve ser feita em álcool 70%. Para posterior realização da imunocitoquímica foram adotados dois intervalos de tempo para a indução neural: 24 e 72 horas, após os quais as células são fixadas.
2 - Obtenção e cultivo das células-tronco neurais
As células-tronco neurais são obtidas a partir de encéfalo de embrião E14 e da zona subventricular (SVZ) de adulto, ambos de camundongos da linhagem balb/c. Os animais utilizados são sacrificados por deslocamento cervical.
Tanto os embriões de camundongo E14 quanto o encéfalo de camundongo adulto são depositados em uma placa de Petri contendo PBS com 2% de glicose. A dissecção é feita em uma lupa e o material obtido é transferido para um tubo adicionando-se em seguida 5 mL do meio de cultura suplementado. A seguir o tecido é triturado passando pela pipeta com ponteira de 1.000 mL seguido pela ponteira de 200 mL, até obter-se uma suspensão de células únicas. As células obtidas são quantificadas e a viabilidade avaliada usando Trypan Blue (GibcoBRL).
As células são plaqueadas em frascos T-25 canted neck (Corning) na densidade de 2x105 células por mL em 10 mL de meio de cultura completo. O meio de cultura para as células tronco neurais é composto por 10% de NeuroCultTM NSC Proliferation Supplements (StemCell Technology) e 90% de NeuroCultTM NSC Basal Medium (StemCell Technologies), específicos para murinos. Além disso também deve ser adicionado hEGF (20 ng/mL), FGF-2 (20 ng/mL) e heparina (5 mg/mL). As neuroesferas são centrifugadas a 1.200 rpm por 5 minutos e metade do meio de cultura de cada frasco é trocado a cada 3 ou 4 dias, substituindo por meio de cultura fresco. As neuroesferas formadas são mantidas numa estufa a 37 ºC, com controle de umidade (maior que 95%) e da proporção de CO2 (5%) no ar.
Indução de diferenciação - Primeiramente as neuroesferas devem ser dissociadas mecanicamente – passando-se pelas ponteiras de 1.000 mL e de 200 mL – e plaqueadas em lamínulas de vidro revestidas com poli-lisina e laminina, que promovem a adesão das células. Após terem aderido, permanecem em poços (Multiwell de 12) contendo 1 mL de meio de cultura composto por NeuroCultTM NSC Basal Medium, NeuroCultTM NSC Proliferation Supplements e 2% de soro fetal bovino (SFB) (StemCell Technology), sem fatores de crescimento. As células são mantidas nesse meio de cultura em estufa (37 ºC, 5% CO2, umidade > 95%) por 1 dia, quando inicia-se o tratamento com o meio de indução de diferenciação.
Cada poço recebe uma combinação específica de compostos, adicionados ao meio de cultivo descrito acima (volume final = 1 mL), que induzem diferenciação em determinado tipo celular, como segue adiante:
a) Diferenciação neuronal: adiciona-se ácido-retinóico all-trans (RA) (Sigma) e forscolina (Fsk) (Sigma) em concentração final de 0,1 mM e 5 mM, respectivamente.
b) Diferenciação em astrócito: adiciona-se 50 ng/mL de proteína morfogenética de osso-2 (BMP-2 - R&D System), 50 ng/mL de fator inibitório de leucemia (LIF - Sigma) e 1% de soro fetal bovino (StemCell Technology).
c) Diferenciação em oligodendrócito: adiciona-se 500 ng/mL de IGF-1 (insulin-like growth factor-1 - R&D System).
As células permanecem no meio indutor de diferenciação por 5 dias, que é substituído no terceiro dia.
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